Un interruptor genético controla la colonización superficial de Pseudomonas aeruginosa | Weifang BrightMountain Ventures Co., Ltd.

Nature Microbiology (2023)Citar este artículo

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La colonización eficiente de las superficies mucosas es esencial para patógenos oportunistas como Pseudomonas aeruginosa, pero no está claro cómo las bacterias se adaptan colectiva e individualmente para optimizar la adherencia, la virulencia y la dispersión. Aquí identificamos un cambio genético estocástico, hecR-hecE, que se expresa bimodalmente y genera subpoblaciones bacterianas funcionalmente distintas para equilibrar el crecimiento y la dispersión de P. aeruginosa en las superficies. HecE inhibe la fosfodiesterasa BifA y estimula la diguanilato ciclasa WspR para aumentar los niveles de segundo mensajero de c-di-GMP y promover la colonización de la superficie en una subpoblación de células; las células que expresan HecE de bajo nivel se dispersan. La fracción de células HecE+ se ajusta a diferentes factores de estrés y determina el equilibrio entre la formación de biopelículas y la dispersión celular de largo alcance de las comunidades que crecen en la superficie. También demostramos que la vía HecE representa un objetivo farmacológico para contrarrestar eficazmente la colonización de la superficie de P. aeruginosa. La exposición de tales estados binarios abre nuevas formas de controlar las infecciones de las mucosas por un importante patógeno humano.

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Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante este estudio están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable. Se puede acceder a los archivos de secuenciación sin procesar del experimento de inmunoprecipitación de cromatina con secuenciación en el NCBI con el número de acceso PRJNA900431. Los materiales biológicos únicos están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable. Las coordenadas estructurales del dímero de estado R de BifA están depositadas en la biblioteca PDB con el número de acceso 8ARV.

Se puede acceder al código generado para el análisis de datos de citometría de flujo en https://github.com/Jenal-Lab.

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Damos las gracias a F. Hamburger (Biozentrum, Universidad de Basilea) por su ayuda con la clonación. Agradecemos a E. Maffei y A. Harms (Biozentrum, Universidad de Basilea) por su apoyo con el aislamiento y la caracterización de fagos. Este trabajo fue apoyado por una beca de doctorado de Biozentrum para CM, la Fundación Nacional de Ciencias de Suiza (subvención n.º 310030_189253 a UJ), el NCCR AntiResist financiado por la Fundación Nacional de Ciencias de Suiza (subvención n.º 51NF40_180541 a KD y UJ), el Consejo Europeo de Investigación (subvención n.º 716734 a KD) y subvenciones de Sygeforsikring Danmark, Danish Innovation Fund y Novoseed a MG y TT-N.

tina jager

Dirección actual: Departamento de Biomedizina, Universidad de Basilea, Basilea, Suiza

jacob malone

Dirección actual: Departamento de Microbiología Molecular, Centro John Innes, Norwich, Reino Unido

Biozentrum, Universidad de Basilea, Basilea, Suiza

Christina Manner, Raphael Dias Teixeira, Dibya Saha, Andreas Kaczmarczyk, Raphaela Zemp, Fabian Wyss, Tina Jaeger, Benoit-Joseph Laventie, Jacob G. Malone, Sebastian Hiller, Knut Drescher y Urs Jenal

sciCORE, Centro de Computación Científica, Universidad de Basilea, Basilea, Suiza

sebastien boyer

Departamento de Química, Universidad Técnica de Dinamarca, Lyngby, Dinamarca

Katrine Qvortrup

Costerton Biofilm Centre, Universidad de Copenhague, Copenhague, Dinamarca

Jens Bo Andersen, Michael Givskov y Tim Tolker-Nielsen

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Conceptualización: CM, TJ y UJ Metodología: CM, RDT, DS, AK, RZ, TJ, B.-JL, JGM, JBA, MD, TT-N., KQ, KD y UJ Análisis formal: CM, RDT, SB y DS Investigación: CM, RDT, DS, RZ, TJ, JGM, FW y JBA Redacción (borrador original): CM y UJ Adquisición de fondos: MG, TT-N., KD, KQ, SH y UJ Supervisión: SH, KD y UJ

Correspondencia a Urs Jenal.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Microbiology agradece a Tim Rick, Daniel Wozniak y los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

a, Morfología de la colonia del mutante hecR::Tn. b, Morfología de colonias de cepas con deleción WT y hec. Los experimentos se realizaron por triplicado; se muestra una imagen representativa. c, Crecimiento de cepas con deleción hec y WT de P. aeruginosa con valores medios y la desviación estándar de tres réplicas biológicas (con seis réplicas técnicas cada una). d, Crecimiento de cepas con deleción WT y hec que contienen plásmidos para la expresión de genes hec a partir de un promotor inducible por IPTG (EV, plásmido de control). Se registró el crecimiento en LB (líneas discontinuas) o LB suplementado con IPTG 100 µM (líneas continuas) y se muestran los valores medios y la desviación estándar de tres réplicas biológicas (con tres réplicas técnicas cada una). e, Morfología de la colonia de P. aeruginosa WT y mutantes que carecen de exopolisacáridos Pel o Psl que expresan hecE de un promotor inducible por IPTG. Los experimentos se realizaron por triplicado; se muestra una imagen representativa.

a, Esquema de la arquitectura del dominio BifA y el fragmento BifA identificado por Y2H para interactuar específicamente con HecE (TM, dominio transmembrana; SID, dominio de interacción más pequeño). b, Estructura tridimensional de un dímero BifA incrustado en la membrana citoplasmática (gris) según lo predicho por AlphaFold. c, análisis CoIP-MS de HecE. Los experimentos de inmunoprecipitación se realizaron utilizando la cepa PAO1 WT o una cepa que expresa HecE marcada con FLAG en el extremo C y cuentas magnéticas conjugadas con anti-M2. Las proteínas retenidas en las perlas se analizaron mediante espectrometría de masas. Los datos obtenidos de tres réplicas biológicas se muestran como gráficos de volcanes. Se calcularon las relaciones de intensidad transformadas con Log2 de los péptidos detectados entre HecE-Flag y WT (ctrl) y se representaron gráficamente frente a los valores derivados del análisis de significancia (estadística t modificada, método Bayes empírico59). d, Morfología de la colonia de cepas mutantes y de tipo salvaje de P. aeruginosa que contienen un plásmido vacío (EV) o un plásmido que expresa hecE de un promotor inducible por IPTG. Los experimentos se realizaron por triplicado; se muestra una imagen representativa. e, Crecimiento (arriba) y fluorescencia (niveles de c-di-GMP, abajo) de cepas de P. aeruginosa de tipo salvaje (WT), hecR::Tn y ΔbifA que llevan un control de plásmido (EV) o un plásmido que expresa el c- Sensor di-GMP cdVerde. Se muestran los valores medios y la desviación estándar de dos réplicas biológicas (con seis réplicas técnicas cada una).

a, la expresión de hecR aumenta los niveles de HecR y HecE. Análisis de inmunotransferencia de HecR y HecE en cepas que expresan copias cromosómicas marcadas con Flag de hecR o hecE. Las cepas contenían un plásmido que expresaba hecR, hecE o ambos genes de un promotor inducible por arabinosa (EV, plásmido de control). Los extractos de células cultivadas en presencia (+) o ausencia (-) del inductor arabinosa se analizaron mediante inmunotransferencia con un anti-Flag (n = 1). b, HecR se une a la región promotora de hecRE. Los ensayos EMSA se llevaron a cabo con ADN marcado que contenía la región promotora hecRE y con concentraciones crecientes de proteína HecR purificada, como se indica (n = 2). c, HecR se une exclusivamente al locus hecRE en el cromosoma de P. aeruginosa. Los experimentos de extracción de cromatina se realizaron con una cepa que expresaba una copia de hecR marcada con HA en ausencia de la copia cromosómica de hecR de tipo salvaje y con anticuerpos específicos de HA. Las lecturas de secuenciación se trazan en el eje y para todo el cromosoma de P. aeruginosa (arriba) o el locus hecRE (abajo). Los gráficos se generaron utilizando Geneious versión 2019.0 creado por Biomatters. d, La fracción de células que expresan cambios hecE durante el crecimiento de P. aeruginosa. La densidad óptica (líneas continuas) y la fluorescencia (expresión de hecE; líneas discontinuas) se registraron durante el crecimiento de cepas indicadoras de hecRE-2mR que contenían un plásmido que expresaba hecR, hecE o ambos genes de un promotor inducible por IPTG (EV, plásmido de control). Los valores medios y la desviación estándar se muestran para tres réplicas biológicas con tres réplicas técnicas cada una. e, La fracción de células que expresan hecRE es independiente del medio de cultivo. Se cultivó P. aeruginosa de tipo salvaje que porta el reportero cromosómico hecRE-2mR en el medio indicado durante 20 h. Se muestra la cuantificación de los datos de citometría de flujo para tres réplicas biológicas. Los triplicados se ajustaron de forma independiente. Se muestran la media y el rango de los valores calculados. La normalidad de las medias se comprobó mediante la prueba de Shapiro-Wilk (P < 0,05). Se utilizó una prueba ANOVA de una vía para analizar las diferencias en las medias de la población (con P < 0,05), seguida de la prueba post-hoc HSD de Tukey, para la cual se muestran los valores de P ajustados. f, La fracción de células que expresan hecRE varía durante el crecimiento de P. aeruginosa. Las cepas indicadoras de hecRE-2mR que portaban un plásmido que expresaba hecR de un promotor inducible por IPTG se diluyeron nuevamente en LB fresco y se cultivaron durante 12 h (EV, plásmido de control). Las intensidades de fluorescencia del reportero, medidas por citometría de flujo, se muestran como gráficos de violín (eje y izquierdo) y el crecimiento se indica en líneas punteadas (eje y derecho). Las células con valores de señal superiores al umbral indicado (línea gris) se contaron como células que expresaban hecRE-2mR. g, La expresión de hecRE responde a las limitaciones de nutrientes. La cepa informadora hecRE-2mR de P. aeruginosa se cultivó en medio mínimo MOPS con diferentes cantidades de succinato como única fuente de carbono. El crecimiento y la fracción de células que expresan hecRE se indican como en la Fig. 3f. h,i, datos de citometría de flujo del reportero hecRE-2mR en mutantes ΔrsmA (h) y ΔrpoS (i), cultivados en MOPS con las cantidades indicadas de succinato a 37 °C. Se cuantificaron las células con mayor intensidad de fluorescencia que la cepa de tipo salvaje PAO1 (eje derecho). La densidad óptica del cultivo antes de la citometría de flujo se indica con líneas punteadas (eje izquierdo). j, La expresión ectópica de hecR induce la transcripción de hecE solo en la fase estacionaria. Análisis de citometría de flujo de cepas con el reportero hecRE-2mR en el tipo salvaje (WT) y mutantes indicados. Las cepas indicadoras que contenían un plásmido que expresaba hecR se cultivaron en LB suplementado con IPTG 100 µM hasta la fase exponencial o durante 20 h (estacionario). Los experimentos de citometría de flujo se muestran para tres réplicas biológicas con los histogramas individuales apilados en el gráfico. k, la fracción de células que expresan hecRE aumenta a temperatura elevada. La cepa informadora hecRE-2mR de P. aeruginosa que alberga un plásmido que expresa hecR de un promotor inducible por IPTG se cultivó en MOPS + succinato 20 mM suplementado con IPTG 100 µM a temperaturas crecientes, como se indica (EV, plásmido de control). Los experimentos de citometría de flujo se muestran para tres réplicas biológicas con los histogramas individuales apilados en el gráfico. l, Exploración sin recortar de la inmunotransferencia que se muestra en a. m, estrategia de activación utilizada para los experimentos de citometría de flujo. Se muestra una de las tres réplicas del tipo salvaje que lleva el reportero hecRE-2mR.

a, d, Aumento del volumen de biopelícula de cepas mutantes y de tipo salvaje de P. aeruginosa. Las biopelículas se segmentaron en cubos con una longitud lateral de 2,34 µm usando BiofilmQ70 y los volúmenes de biopelículas se calcularon como la suma de todos los cubos individuales en un momento dado. La línea roja indica el inicio del evento de dispersión. El análisis de un experimento se muestra en cada panel. b, e, los parámetros del objeto, incluida la distancia al límite de la biopelícula (resolución, 20 vóxeles), las intensidades fluorescentes y la densidad celular local se calcularon utilizando BiofilmQ. c, f, las intensidades fluorescentes al comienzo del evento de dispersión (línea roja) se trazaron y codificaron por colores según su distancia al límite de la biopelícula.

a, Desviación estándar de la media de los datos adjuntos que se muestran en la Fig. 5a. b, Unión basada en placa de microtitulación de cepas WT y mutantes que portan un plásmido que expresa la diguanilato ciclasa dgcZ de E. coli de un promotor inducible por IPTG y varios alelos bifA de un promotor inducible por cumato (EV, plásmido de control). No se indujo la expresión de BifA, se indujo la expresión de dgcZ con IPTG 100 µM. Se añadió H6-335-P1 a las concentraciones indicadas. El apego se cuantificó después de 9,5 h. Se muestran los valores medios de dos réplicas biológicas. c, Disposición de α6 y α5′ del dímero PdeL en el estado R- (PDB: 4LYK) y T (PDB: 4LJ3). Los residuos del sitio activo y los residuos involucrados en la estabilización de la conformación del estado T se resaltan y se muestran como una representación de barras. d, Disposición de α6 y α5 'del dímero BifA en el R- (PDB: 8ARV) y estado T modelado. Los residuos del sitio activo y los residuos conservados postulados para estabilizar la conformación del estado T se resaltan y se muestran como una representación de barras. e,f, Desviación estándar de la media de los datos adjuntos que se muestran en la Fig. 5d,e, respectivamente.

pantalla VMD

Tamiz de dos híbridos de levadura

Pantalla supresora SCV

Recopilación de datos de estructura y estadísticas de refinamiento

Las células de P. aeruginosa que expresan hecE permanecen unidas después de la dispersión del biofilm.

La dispersión celular a partir de biopelículas cultivadas en cámaras de flujo es un proceso altamente coordinado.

Los mutantes que carecen de HecE no logran mantener una biopelícula madura después de la dispersión celular.

Los mutantes que carecen de BifA experimentan una formación prematura de biopelículas y una dispersión celular.

Los mutantes que carecen de WspR no logran mantener una biopelícula madura después de la dispersión celular.

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Reimpresiones y permisos

Manner, C., Dias Teixeira, R., Saha, D. et al. Un interruptor genético controla la colonización superficial de Pseudomonas aeruginosa. Nat Microbiol (2023). https://doi.org/10.1038/s41564-023-01403-0

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Recibido: 19 Octubre 2022

Aceptado: 05 mayo 2023

Publicado: 08 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41564-023-01403-0

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